Diferència clau: traducció de Nick i Primer Extension

La traducció de Nick i l’extensió d’imprimació són dues tècniques importants realitzades en biologia molecular. La diferència clau entre la traducció de nick i l’extensió d’imprimació és que el procés de traducció de nick produeix sondes marcades per a altres tècniques d’hibridació mentre que el mètode d’ampliació d’imprimació identifica una seqüència d’ARN específica a partir d’una barreja i revela informació sobre l’expressió de mRNA. Ambdues tècniques tenen una gran importància i es realitzen de forma rutinària en laboratoris d'investigació molecular.

CONTINGUTS 1. Visió general i diferències claus 2. Què és la traducció de Nick 3. Què és l'extensió primària 4. Comparació de costat a costat - Traducció de Nick i Extensió de Primer

Què és Nick Translation?

La traducció de Nick és una tècnica important utilitzada per preparar sondes marcades per a diverses tècniques biològiques moleculars com ara blot, hibridació in situ, hibridació fluorescent in situ, etc. És un mètode in vitro d’etiquetatge d’ADN. Les sondes d’ADN s’utilitzen per identificar seqüències d’ADN o ARN específiques. Amb l’ajuda d’una sonda marcada, es poden marcar o visualitzar fragments específics a partir d’una barreja complexa d’àcid nucleic. Per tant, les sondes etiquetades es preparen mitjançant diverses tècniques que s’utilitzaran per a diferents tècniques. La traducció de Nick és un mètode que produeix sondes marcades amb l'ajuda d'enzims DNase 1 i ADN polimerasa 1.

El procés de traducció de nick s’inicia amb l’activitat de l’enzim DNase 1. La DNasa 1 introdueix nicks a la columna vertebral del fosfat de l'ADN de doble cadena eliminant els enllaços de fosfodièster entre nucleòtids. Un cop creat el nick, es produirà un grup lliure de 3 'OH del nucleòtid i l'enzim ADN polimerasa 1 actuarà sobre ell. L'activitat exonucleasa de 5 a 3 'de l'ADN polimerasa 1 elimina els nucleòtids del nick cap a la direcció 3' de la cadena de l'ADN. Simultàniament, l’activitat de la polimerasa de l’enzim ADN polimerasa 1 funciona i afegeix nucleòtids per substituir els nucleòtids eliminats. Si es marcaven els nucleòtids, la substitució es produirà pels nucleòtids marcats i marcarà l'ADN per a la seva identificació. Aquest ADN marcat recentment sintetitzat es pot utilitzar com a sondes en diverses reaccions d’hibridació en Biologia Molecular.

Què és Primer Extension?

L'extensió primer és una tècnica que s'utilitza per trobar una seqüència d'ARN específica d'una barreja d'ARN i localitzar l'extrem 5 'de la transcripció de l'ARNm. També s’utilitza per estudiar l’estructura de l’ARN i l’expressió. El mètode d’extensió d’imprimació es porta a terme amb imprimadors marcats o amb nucleòtids marcats. Si s’utilitzen primerrs marcats, s’exclou la necessitat d’etiquetar els nucleòtids que s’utilitzen per a la síntesi d’ADNc. Hi ha diversos passos en aquesta tècnica. Comença amb l’extracció d’ARN de la mostra. A continuació, s’afegeix un primer oligonucleòtid marcat a la barreja juntament amb els ingredients necessaris per sintetitzar l’ADNc d’una seqüència d’ARN específica. Primers recuits amb la seqüència complementària de la barreja. Utilitzant la seqüència recoberta d’imprimació com a plantilla, l’enzim revers transcriptasa sintetitza l’ADN complementari (ADNc) de la seqüència d’ARN. El primer recuit i la transcripció inversa només es produeixen quan la seqüència d’ARN específica està present a la mostra. Finalment, quan es realitza una electroforesi en gel desnaturalitzant, es pot determinar la mida de la seqüència d’ARN. També és fàcil trobar la base +1 de la seqüència d’ARNm (lloc d’iniciació a la transcripció) mitjançant el mètode d’ampliació d’imprimació. Si es fa servir un excés d’imprimació, es pot quantificar la quantitat d’ARNm present a la mostra.

Quina diferència hi ha entre Nick Translation i Primer Extension?

Resum: Nick Translation vs Primer Extension

La traducció de Nick és un mètode utilitzat per sintetitzar sondes marcades basades en les activitats dels enzims DNase 1 i E coli DNA polimerasa 1. És un mètode in vitro emprat als laboratoris abans de diferents tècniques d’hibridació. Durant la traducció de nick, l'activitat exonucleasa 5'-3 'de l'ADN polimerasa 1 elimina els nucleòtids per davant del nick i l'activitat de la polimerasa de l'ADN polimerasa 1 substitueix els nucleòtids eliminats pels nucleòtids marcats darrere del nick. L'extensió primer és un mètode que s'utilitza per detectar una transcripció d'ARN específica d'una barreja i quantificar la mida i la quantitat de l'ARN d'interès. Aquesta és la diferència entre traducció de nick i extensió de primer.

Referències 1. Reid, Alex. "Traducció Nick". Springer. Np, nd web. 18 d'abril de 2017 2. "Primer Extension". Diagnòstic nacional. Np, nd web. 19 d'abril de 2017 3. Kuo, MT, i W. Plunkett. "Nick-traducció de cromosomes metafase: etiquetatge in vitro de regions nuclears hipersensibles en cromosomes." Actes de l'Acadèmia Nacional de Ciències dels Estats Units d'Amèrica. Biblioteca Nacional de Medicina dels Estats Units, febrer de 1985. Web. 19 d'abril de 2017 4. Raymond et al. "Assaig de PCR simple i extensiu quantitatiu per a control directe de microRNAs i ARN d'interferència curta". ARN. Copyright 2005 de RNA Society, novembre de 2005. Web. 19 d'abril de 2017

Cortesia d’imatges: 1. “Primer Extension Test” de Jjnmmnjj - Treball propi (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia